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CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

  • Foto do escritor: InfoVid-19 Winx
    InfoVid-19 Winx
  • 22 de jun. de 2021
  • 14 min de leitura

No decorrer deste trabalho conhecemos um pouco mais sobre a COVID-19, seu agente causador, fisiopatologia e sua principal protease (Mpro). Também falamos sobre um possível inibidor conhecido como GC376, que pode vir a se tornar um fármaco contra a COVID-19 e introduzimos alguns conceitos da química medicinal e planejamento de fármacos, como modificações estruturais, visando a melhora das propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmica do inibidor em questão.

Após elaborarmos estruturas análogas do inibidor GC376, denominadas InfoVid 1, InfoVid 2 e InfoVid 3 (Figura 1), foi possível analisá-las a partir das predições in sílico realizadas nas plataformas SwissADME e ADMET-lab, para verificar se, de fato, houve melhora das propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas desejadas.


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Figura 1: Molécula original e análogos InfoVid. Fonte: próprio autor.



QUAL É O MELHOR?


Um bom fármaco, como já discutimos anteriormente, apresenta boa efetividade e, de preferência, baixa toxicidade. Será que nossos análogos demonstraram essas características? Fizemos uma tabela para compará-los (tabela 1):

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Tabela 1: comparação das propriedades de todos os análogos e do GC376. Fonte: ADMETlab (a) ; SwissADME (s).


Primeiro: A lipofilicidade, um dos principais fatores que pode afetar a taxa e absorção de um fármaco, como já vimos anteriormente e ela pode impactar diretamente na biodisponibilidade oral. Entretanto, é importante ressaltar que o fármaco precisa ter um equilíbrio entre hidrossolubilidade e lipossolubilidade, uma vez que a substância precisa apresentar lipossolubilidade razoável para ser capaz de permear as membranas lipídicas e deve ser razoavelmente solúvel em água para se dissolver no conteúdo do trato G.I. Comparando os valores de Log S, percebemos que todos os ligantes apresentaram solubilidade moderada em água, no entanto, em relação ao LogP, o InfoVid 3 apresentou uma maior lipofilicidade.

Quanto à farmacocinética, todas as moléculas apresentaram baixa absorção G.I, mas, como podemos observar no gráfico boiled egg a seguir (gráfico 1) a molécula mais capaz de atravessar o G.I foi o InfoVid 2:

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Gráfico 1: Boiled egg dos InfoVid 1 (ponto azul sem nome), InfoVid 2 (molecule 3), InfoVid 3 (molecule 4) e GC376 (molecule 1). Fonte: SwissADME.









No metabolismo, as diferenças foram poucas, salvo os análogos 2 e 3 que demonstraram, respectivamente: incapacidade de inibir a CYP3A4, mas capacidade de ser seu substrato, e capacidade de agir como substrato da CYP2C9. Quando uma substância atua como substrato de algumas dessas enzimas, pode resultar em uma baixa biodisponibilidade ocasionada por uma metabolização pré-sistêmica e, se uma substância atuar como inibidor de algumas dessas enzimas, pode haver influência no aumento da concentração plasmática de um fármaco coadministrado que é metabolizado por alguma dessas isoformas, aumento da meia vida e consequentemente aumento dos efeitos tóxicos (GUENGERICH, 1999). E falando em efeitos tóxicos, esses tiveram variações importantes. A molécula mais tóxica considerando todos os fatores foi o análogo 3, perdendo apenas em sensibilização da pele para o análogo 2. A molécula menos tóxica foi o análogo 2 com uma LD50 de mais de 1 grama por kilograma, o dobro do GC376, um pouco menor que o dobro do análogo 1 e um pouco mais que o dobro do análogo 3.

Após essa análise, concluímos que o melhor candidato é o análogo 2, levando em consideração as propriedades ADMET e suas características farmacocinéticas e farmacodinâmicas. Sobre a farmaco-similaridade, apenas o InfoVid 2 apresentou positividade em Lipinski.


VIABILIDADE SINTÉTICA INFOVID 2


O primeiro passo é verificar a possibilidade de síntese da nossa molécula. Pela plataforma SwissADME, conseguimos a informação de que a acessibilidade sintética do InfoVid 2 é de 5,22, esse valor obtido corresponde a uma dificuldade média para a síntese da nossa molécula (sendo de 1 a 10, respectivamente, do mais fácil de sintetizar ao mais difícil).

A síntese de novos compostos orgânicos é um importante fator a se considerar para o desenvolvimento de novos fármacos, pois a partir desses compostos é possível identificar fármacos promissores com diferentes modos de ação, de modo que a otimização química apresente efetividade e segurança (SANGI, 2016).

Pensando na síntese do InfoVid 2, buscamos na literatura uma rota sintética já descrita para a obtenção do inibidor original (GC376), pois poderíamos adaptá-la de modo a se obter o InfoVid 2. (RATHNAYAKE et al., 2020). Essa rota sintética pode ser observada na Figura 2.


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Figura 2: Rota de síntese do CG376. Fonte: RATHNAYAKE et al., 2020


Como a diferença estrutural entre o GC376 e o InfoVid 2 está na cadeia lateral da porção carbamato, que se tornou uma amida em nosso análogo, basta que alteremos a primeira etapa da rota sintética. Assim, por meio de uma reação de acoplamento peptídico entre o ácido trans-cinâmico (1) e a amina (2), usando o N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) como agente de acoplamento e diclorometano como solvente, o intermediário 3 poderia ser sintetizado (Figura 3). Uma vez obtido, esse intermediário seria submetido às mesmas reações, indicadas na Figura 2, para obtenção do InfoVid 2.

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Figura 3: Acoplamento peptídico entre o ácido trans-cinâmico e o precursor do InfoVid 2. Fonte: próprio autor.


ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS: BIOLÓGICOS, TOXICOLÓGICOS, TRIAGENS DE ALTO DESEMPENHO.


O processo de planejamento e desenvolvimento de um medicamento exige tempo e custo. Para o lançamento de um produto no mercado, podem ser feitos investimentos superiores a US$ 1,38 bilhões (IFPMA, 2015). Além disso, esse processo pode ser dividido em pesquisa básica, testes pré-clínicos, testes clínicos e farmacovigilância, sendo que cada etapa possui suas especificidades. É estimado que a cada dez mil compostos descobertos, apenas uma pequena parcela são submetidos aos ensaios pré-clínicos, variando em até 250 compostos. Destes, apenas 5 são submetidos aos ensaios clínicos e apenas 1 chega no mercado (GOMES, et al., 2012).

A pesquisa básica, inclui todos os procedimentos necessários para a identificação e validação do alvo terapêutico, bem como das moléculas candidatas. Estes procedimentos de pesquisa citados estão relacionados com todo o trabalho que fizemos até aqui. Uma vez que a síntese de novos compostos demonstram resultados promissores, estes são submetidos a ensaios pré-clínicos (GOMES, et al., 2012).

Os ensaios pré-clínicos tem como intuito descobrir ou confirmar os efeitos farmacológicos e identificar efeitos tóxicos do candidato a fármaco, podendo ser realizadas in vitro (ensaio feito com células, fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado do laboratório), in vivo (ensaio feito em animais vivos em ambiente controlado e normalmente fechado de um laboratório), ou em ex vivo (ensaio feito sobre o tecido de um organismo em ambiente com mínima alteração das condições naturais) (BRASIL, 2013). Os ensaios clínicos, por sua vez, têm como objetivo a obtenção da segurança e eficácia. Mesmo após todos esses processos de testes e a comercialização do novo medicamento, a atividade não se encerra por aí, pois o uso do medicamento é acompanhado permanentemente pela farmacovigilância (CONSELHO REGIONAL DE FARMÁCIA, 2015). A seguir descreveremos alguns processos no qual um do candidato a fármaco pode passar.


1 - ENSAIOS BIOLÓGICOS


Os ensaios biológicos são essenciais no desenvolvimento de novos medicamentos, já que, são métodos de estudos que caracterizam determinado fármaco e seu comportamento no organismo, ou seja, investigam os efeitos de uma substância em um órgão isolado ou em um organismo vivo. Desse modo, esses ensaios são fundamentais na determinação de características elementares para que um fármaco seja introduzido no mercado (LYRA, 2020).

2 - ENSAIOS DE TOXICIDADE


Durante o desenvolvimento de novos fármacos, é necessário ensaios DE TOXICIDADE, os quais demonstram de forma prática a segurança no organismo, antes de serem comercializados. Além disso, por meio desses ensaios, surgem informações, as quais serão escritas na bula do medicamento, deixando aquele que a administra ciente de seus efeitos negativos e positivos no organismo (LAVANDEIRA, 2014).

Os principais tópicos avaliados são:

  • toxicidade geral, tanto por dose única ou repetida;

  • genotoxicidade (se causam alterações no genes);

  • carcinogenicidade (se aumenta o risco do desenvolvimento de câncer);

  • imunotoxicidade (se prejudicam a atuação do sistema imune);

  • toxicidade sobre a função reprodutora.

Após a realização de cada tópico mencionado anteriormente, o órgão regulador, o qual está avaliando o novo fármaco concluirá se:

  • este fármaco possui ação terapêutica por meio da dose, indicando qual é a dose mínima e máxima que pode ser administrada sem causar quaisquer complicações ao indivíduo;

  • como reverter seus efeitos (tanto adversos, quanto pela administração de altas dosagens); (LAVANDEIRA, 2014).

  • qual é o intervalo terapêutico, ou seja, qual será a quantidade de administrações mínimas necessária para que ocorra os primeiros sinais terapêuticos; (LAVANDEIRA, 2014).

  • qual é a melhor via de administração, por exemplo: por via oral, cremes, injeções, intramusculares e entre outros; (LAVANDEIRA, 2014).

  • após avaliar a melhor via de administração, deve-se escolher a melhor forma farmacêutica presente nesta via. (LAVANDEIRA, 2014).


Nestes ensaios, pode-se utilizar cobaias humanas e modelos de animais. Entretanto, deve-se escolher animais com características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas semelhantes à humana. Além disso, é necessário a aprovação de um comitê de ética para autorizar a realização da pesquisa em cobaias (humanas ou não) (LAVANDEIRA, 2014).


3 - TRIAGENS DE ALTO DESEMPENHO


Considerando-se que existem inúmeros alvos (proteína alvo) promissores para o planejamento de fármacos, a triagem de alto desempenho (High throughput screening, ou HTS) têm um importante papel entre as modernas estratégias na identificação de novas substâncias bioativas (FERREIRA, et al., 2011). O HTS é uma forma de separar compostos promissores, daqueles que não possuem efeito, sendo muito utilizadas pela indústria farmacêutica na avaliação de candidatos a fármacos. Por ser um ensaio realizado in vitro, esses testes são apenas indicadores, de modo que, a validação contra determinada doença deve ser realizada em mais ensaios, para confirmar a sua funcionalidade. A seguir descreveremos alguns tipos de triagem realizados.


  • Triagem virtual: Nesse tipo de triagem é utilizado programas de computador, onde são criados modelos tridimensionais do composto em estudo e do alvo de interesse. O teste é realizado através do Docking molecular, no qual os resultados se baseiam na ligação das moléculas de compostos candidatos a sítios específicos da proteína alvo, demonstrando quais compostos tiveram um melhor encaixe, permitindo uma economia de materiais, já que, apenas compostos com boa ligação molécula-alvo vão ser sintetizadas (BORIN, 2020).

  • Triagem fenotípica: Nesse tipo de triagem é utilizado uma cultura de células, onde é adicionado uma quantidade de células em uma placa de ensaio, em seguida é introduzido o composto que será testado e o agente causador da doença, isso faz com que eles interajam entre si, já que, vão estar em contato. Por último, é adicionado corantes no poço para que seja realizado o estudo no microscópio e demonstrar se os compostos tiveram efeito ou não. Caso os estudos demonstrem resultados positivos, é necessário repetir o procedimento para validação, no entanto, uma desvantagem é que esse tipo de teste pode indicar “falsos positivos", ou seja, compostos que parecem funcionar, mas na verdade não tiveram efeito (BORIN, 2020).

  • Triagem bioquímica: Nesse tipo de triagem são selecionadas proteínas e enzimas, que são componentes importantes do agente causador da doença, pois dão forma ao organismo e desempenham funções dentro dele. Essas moléculas são inseridas nas placas de ensaio juntamente com um ligante ou substrato e os compostos candidatos, com o intuito de observar se há interação específica. Nesse estudo, o objetivo é selecionar compostos capazes de fazer com que a proteína não funcione adequadamente, assim inibir a atividade de patógenos (BORIN, 2020).

Diante destas informações, pretendemos realizar testes enzimáticos e citotóxicos baseados na metodologia de RATHNAYAKE et al. (2020), com o objetivo de avaliar a efetividade e segurança do nosso novo fármaco. A partir disso serão realizados testes in vitro para avaliar a sua citotoxicidade, como descrito em CARFI’ et al. (2007) e testes in vivo onde algumas características que já comentamos anteriormente serão averiguadas, como: LD50, hepatotoxicidade, entre outros. Ensaios in vivo e in vitro possuem vários formatos, mas a constância é a presença de um N amostral correto, de acordo com cálculos bioestatísticos, e a presença de um grupo placebo e aprovação de conselhos de bioética (MIOT, 2011; CARFI, et al., 2007).


E O QUE ACONTECE QUANDO A EFICÁCIA DE CANDIDATOS A FÁRMACOS É COMPROVADA?

Uma vez que o efeito farmacológico é comprovado e os candidatos a fármacos apresentam eficácia, potencial atividade biológica, ausência de efeitos colaterais e/ou tóxicos, esses candidatos passam para a fase dos ensaios clínicos. De acordo com a Resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2015), os ensaios clínicos envolvem pesquisas conduzidas em seres humanos, com o intuito de descobrir ou confirmar efeitos clínicos, farmacológicos e identificar possíveis eventos adversos, bem como estudar a absorção, distribuição, metabolismo e excreção do candidato, a fim de verificar sua segurança e eficácia.

As substâncias para uso médico devem apresentar indicações específicas, em função de seu efeito biológico desejado, no qual um ensaio clínico é elaborado. Além do mais, o protocolo e documentação clínica do estudo deve seguir recomendações dos órgãos normativos e de vigilância de medicamentos, para que ao final os resultados obtidos possam ser validados para aprovação. No entanto, testes em seres humanos envolve avaliação específica como, os riscos da intervenção ou da não intervenção no grupo placebo e a consideração de potenciais benefícios do estudo. Além disso, há aspectos éticos que são fundamentais e que devem ser considerados, envolvendo os princípios da voluntariedade e confidencialidade da informação, onde os participantes devem estar informados sobre o que o estudo aborda, metodologias, os exames a serem realizados, aspecto voluntário e a possibilidade de interromperem o estudo quando acharem conveniente, informações estas que devem ser documentados por escrito. Esses protocolos devem ser revisados e aprovados por um Comitê de Ética Institucional, onde vão avaliar o motivo pelo qual os pesquisadores estão realizando esses procedimentos, a qualificação dos profissionais, a documentação e os critérios de segurança e recrutamento dos participantes (BRASIL, 2021).

Por muito tempo, os ensaios clínicos realizadas com seres humanos apresentaram falta de ética, seja por motivos políticos, ideológicos ou econômicos. Desse modo, em 1947 foi elaborado o Código de Nuremberg, ou seja, um código de conduta em pesquisas internacionalmente aceito, para que um estudo científico fosse realizado com um objetivo relevante, com pessoas qualificadas e a obrigação de consentimento informado. Outro documento ético importante está indicado na Declaração de Helsinki, no qual foi elaborado pela Associação Médica Mundial e adotada originalmente em 1964, como um esforço no estabelecimento de critérios imprescindíveis em uma pesquisa clínica (ABRACRO, 2019). Esses princípios podem ser lidos em: Centro de Bioética.


ENSAIOS CLÍNICOS


Em um ensaio clínico, a especificação do produto, a dose, formas de administração, tipos de pacientes que vão receber o tratamento, efeitos esperados, toxicidade, efeitos terapêuticos e resposta imunológica, são alguns dos parâmetros que devem ser determinados inicialmente como um objetivo. Os ensaios clínicos são conduzidos em processos de quatro fases, somente após a conclusão dos testes é que o candidato a fármaco pode ser disponibilizado como medicamento para a população e liberado para o comércio. A seguir descreveremos como ocorre cada fase dos ensaios clínicos. Na Figura 3 temos uma imagem simplificada das etapas.


Figura 3: Fases da pesquisa clínica


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Fonte: Sociedade Brasileira de Profissionais em Pesquisa Clínica, 1999



FASE I: Nesta fase, avalia-se a segurança do fármaco e o estudo é composto por algumas dezenas de voluntários, geralmente sadios, com o intuito de estabelecer segurança, tolerabilidade, farmacocinética do medicamento e, quando possível, determinar o perfil farmacodinâmico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997). Caso o candidato a fármaco demonstre que é seguro, chega-se à fase II.


FASE II: Nesta fase uma quantidade maior de voluntários participa, apesar de ainda haver uma limitação no número de voluntários, no entanto, o objetivo é estabelecer a dose-resposta e a eficácia e a obtenção de informações mais detalhadas sobre a segurança (toxicidade) a curto prazo. Portanto, a realização desse estudo é feita em voluntários portadores de determinadas doenças (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997). Se os resultados obtidos forem promissores, o medicamento pode seguir para a fase III.


FASE III: Nesta fase já se tem o conhecimento que o candidato a fármaco é minimamente seguro e eficaz, no entanto, é importante conhecer se o desempenho é interessante. Portanto, o novo tratamento é comparado com os padrões já existentes e o número de voluntários aumenta significativamente, a fim de determinar a relação risco/benefício a curto e longo prazo e os possíveis efeitos adversos. Isso é feito através de ensaios clínicos randomizados, ou seja, os voluntários são divididos aleatoriamente por sorteio em dois grupos grandes, um grupo recebe o tratamento em teste (grupo experimental) e o outro grupo recebe o tratamento convencional/padrão (grupo controle) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997). Caso os estudos se mostrem favoráveis, o candidato pode ser submetido para aprovação e registro pelos órgãos sanitários responsáveis. As autoridades regulatórias do Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), fazem análise documental pressupondo que esteja tudo correto no dossiê, análise farmacotécnica (técnica de produção de um fármaco), análise de eficácia feito por consultores (médicos/profissionais) e também análise de segurança (quais são os efeitos colaterais e potencial de ação) (BRASIL, 2015).


FASE IV: Após a aprovação da comercialização, a fase IV verifica se os resultados obtidos na fase III são aplicáveis a uma grande parte da população doente. Também permitem acompanhar os efeitos dos medicamentos a longo prazo, o surgimento de novas reações adversas, bem como comparar o perfil do novo medicamento com outros já existentes no mercado. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1997). Nesta etapa, farmacovigilância, tem um papel importante no monitoramento intensivo, identificação, avaliação, compreensão e prevenção de efeitos adversos ou quaisquer problemas relacionados ao uso de medicamentos.


Ao longo deste trabalho pudemos conhecer um pouco sobre o processo da descoberta de potenciais inibidores para o combate à COVID-19. O conhecimento sobre a doença, o alvo molecular e o inibidor é fundamental para que possamos compreender os tipos de interações que ocorrem e algumas propriedades farmacocinéticas/farmacodinâmicas, de modo que o desenvolvimento de análogos sejam elaborados com a maior viabilidade possível. Vimos que a síntese de novos compostos orgânicos tem papel crucial no desenvolvimento de novos fármacos. No entanto, esse processo não é rápido, demanda muita pesquisa, no qual um candidato a fármaco pode ultrapassar 10 anos de estudo para estar disponível no mercado, levando em consideração as etapas da pesquisa experimental e da pesquisa clínica, além de ser altamente custoso. Entretanto, com o avanço tecnológico e científico pode-se ter uma redução nesse tempo, como exemplo temos a corrida em busca da vacina contra a COVID-19.

Relembrando, nesse percurso obtivemos um possível inibidor promissor em relação à molécula original (inibidor GC376), onde a lipofilicidade foi aumentada e a toxicidade diminuída com base nas evidências in silico. O inibidor promissor seria o InfoVid 2, no qual possui uma acessibilidade sintética mediana. Além disso, através da rota sintética descrita para a obtenção do inibidor GC376, pudemos fazer algumas adaptações na mesma pensando na síntese do InfoVid 2. Através do acoplamento peptídico entre o ácido trans-cinâmico e o precursor do InfoVid 2, obtivemos um intermediário que seria submetido às mesmas reações da rota sintética para que o InfoVid 2 pudesse ser sintetizado.


REFERÊNCIAS














 
 
 

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